破壞抗體表面正電荷分布優化抗體PK

很多文獻提到抗體的表面電荷、凈電荷或者pI會影響抗體的PK，今天轉載一篇關于修改抗體表面電荷優化抗體PK的文章，講解了破壞抗體表面連續的正電荷區域可以減少抗體的清除同時延長半衰期，來源：大分子研究員。

文章最后，我們會介紹如何通過WeMol實現文中的分析與設計工作，包括電荷分析和FR替換等，如果您已瀏覽過相關文獻，可以直接跳轉到最后一節。

背景

PK是抗體的重要成藥性指標之一，是機體對藥物吸收、分布、代謝和排泄的過程，單抗的PK可以描述為兩個階段：快速的分布階段和緩慢的清除階段?？贵w的清除比較緩慢是因為抗體的恒定區可以與FcRn在酸性的內體中相互結合從而繼續循環到細胞外，避免被細胞非特異性清除。影響抗體PK的因素包括：抗體聚集、抗體疏水較強、抗體帶較高的正電荷、與細胞外基質的非特異性結合、高甘露糖、TMDD以及ADA等。

文章作者通過雜交瘤獲得一個抗TDP-43的抗體，經過人源化后抗體保持了母抗的特性，但是在NHP中的清除速率較快，通過分析抗體的表面電荷發現抗體表面分布較大的陽性電荷區域，因此重新選擇pI較低的germline做了人源化，新的人源化抗體不但保持了活性而且也延長了半衰期。

結果

使用人germline VH1-3/VK2-30框架區的人源化抗體被快速清除

結合TDP-43的鼠抗克隆號為ACI-5891，恒定區為鼠IgG2a，此抗體結合的表位位于TDP-43的C末端，具有人、鼠、猴種屬交叉反應。ACI-5891鼠抗在小鼠疾病模型中單次給藥30mg/mk半衰期為14天(圖1a)。

首次人源化使用的人源重輕鏈框架區分別是VH1-3和VK2-30，恒定區為人IgG1抗體命名為ACI-5891.1，嵌合抗體名字為ACI-5891.5。人源化的抗體功能以及穩定新都保持與鼠抗一致(表1)。然而人源化以及嵌合抗體在NHP中的半衰期分別為4.6天和4.0天(圖1b)，清除率分別為0.497mL/h/kg和0.716mL/h/kg(表2)。

對ACI-5891.1快速清除的研究

發現嵌合抗體以及人源化的抗體pk較短后，作者對抗體進行了系統的分析，包括：FcRn的結合、分特異性結合、抗體疏水性、糖型、TMDD和電荷分布等等。

結果顯示嵌合抗體與人源化抗體與人FcRn具有pH-dependent binding(圖2a，表1)，但是鼠抗、嵌合抗體和人源化抗體對鼠、人、NHP的FcRn結合并不一致(表3)，因此小鼠中的PK數據轉化到NHP的相關性較差。

抗體的非特異性結合通過與一些負電荷的細胞外基質結合實驗來模擬，包括heparin和insulin，ACI-5891.1和ACI-5891.5均沒有非特異性結合(圖2b)。根據對抗體結構的計算，ACI-5891.1表面沒有明顯的疏水區域且具有較低的聚集傾向(圖2c)。當濃縮到120mg/ml抗體并沒有發生聚集，粘度為3.0cP。ACI-5891.1的糖型表現正常，甘露糖含量正常(表4)。ACI-5891.1具有人猴交叉反應，猴血清中TDP-43濃度為800pg/mL(18 pM)，但在終點抗體的濃度為3.24nM大概為游離TDP-43的180倍，這說明TMDD也不是抗體快速清除的原因。然后在血細胞的表面也為觀察到ACI-5891.1，血細胞的結合也不是抗體快速清除的原因。

選擇新的人源germline對ACI-5891.5抗體進行人源化

根據以上結果，未能發現影響抗體清除率的原因，但是通過對數據的分析猜想可能是抗體攜帶的正電荷所導致，抗體表面分布較大量的正電荷區域 (圖3a)。對抗體進行重新人源化，通過序列比對選擇了與鼠抗相似度較高且攜帶負電荷的germline：VH1-69-2/VK2-28 (圖3b)。

通過更換germline將鼠抗上較大的正電荷區域打斷(VH：K74Q、R82aS和K73T；VK：K45Q)，人源化的抗體命名為ACI-5891.9，新抗體的凈電荷為+4.3理論pI為6.9(表1)，計算的表面電荷較ACI-5891.1和ACI-5891.5更加的均勻(圖4)。ACI-5891.9的活性和穩定性都與ACI-5891.5保持一致(圖5，表1)。

ACI-5891.9減低了清除率

首先在轉基因小鼠Tg32中比較了ACI-5891.1、ACI-5891.5和ACI-5891.9的PK(圖6a，表5)。單次IV給藥40mg/kg，ACI-5891.1清除率為0.428mL/h/kg，ACI-5891.5清除率為0.235mL/h/kg，ACI-5891.9清除率為0.183mL/h/kg；ACI-5891.9的半衰期為16.4天，ACI-5891.5和ACI-5891.1分別為9.6和10.8天。在NHP中ACI-5891.9的清除率為0.083mL/h/kg，半衰期為12.7天(圖6b，表2)。綜上，Tg32小鼠和NHP的數據都說明ACI-5891.9具有更低的清除率和更長的半衰期。根據NHP和Tg32小鼠的數據預測了ACI-5891.9在人體的表現，半衰期預計在27-30天左右，優于ACI-5891.1的17到22天。

討論

這篇文章說明在抗體人源化的同時對抗體表面電荷的優化可以一定程度上改善抗體的PK。也強調在做人源化的時候需要確認人源germline的各項成藥性指標，選擇參數最優的germline，比如這篇文章提到的電荷（pI）。

文章一開始根據序列相似度最優挑選的人源化抗體的germline為VH1-3/VK2-30，雖然人源化的抗體可以保持親和力和穩定性，但是PK與嵌合抗體一樣比較低，隨后更換了含較少堿性氨基酸（pI更低）的germline VH1-69-2/VK2-28，將鼠抗中重鏈K64、R82a、K73和輕鏈K45突變成不帶電荷的氨基酸，破壞了抗體表面大面積的正電荷聚集區域。最終ACI-5891.9的電荷減少了5.8，從而延長了抗體的半衰期。

參考文獻

1.?Improved antibody pharmacokinetics by disruption of contiguous positive surface potential and charge reduction using alternate human framework

抗體人源化是對非人源抗體的二次改造，在改造過程中為保證良好的成藥性，需要同時對潛在問題進行優化。如鼠抗PI偏高，可采用上文所述的方案，通過優化抗體表面電荷來改善抗體PK。除此之外，PTM性質、溶解度、粘度等都是評估抗體可開發性的重要指征。唯信計算自主開發的分子智能計算平臺WeMol不僅可對上述所有指征進行計算和預測，還將抗體人源化工作涉及的步驟串聯起來形成了一套簡潔的自動化流程。另外，計算結果也可借WeMol強大的可視化界面進行呈現哦！

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1、?基于序列分析pI

在WeMol中計算pI很簡單，直接在序列編輯器WeSeq中打開要分析的序列，在下方的Table面板中即自動顯示pI數值，同時Chart面板中會以柱狀圖顯示pI的分布，如下圖所示。

2、?基于結構分析表面電荷

使用WeMol的結構編輯器WeView打開抗體結構PDB文件，點擊Patch Analysis功能，即可分析結構表面的靜電荷及疏水殘基的分布，自動標識出富集區域及對應的氨基酸殘基，這對于預測基于非共價相互作用的可逆聚集現象也很有用，如下圖所示。

如果沒有抗體三維結構，可以在WeMol中使用AlphaFold、ESMFold等功能先行預測，使用生成的PDB文件再進行分析即可。

3、?在人源化時定向生成特定pI的人源化變體

使用WeMol的抗體人源化功能，可以使用特定pI的germline對抗體FR進行替換。在WeSeq中點擊Humanization->Numbering->Search Template，系統會自動推薦germline模板及輕重鏈組合，推薦策略包括基于模板評分（側重同源性與成藥性，下圖中1至4組）、人源化后pI的多樣性（下圖中5、6組為維持母本pI，7、8組為升高pI，9、10組為降低pI），可以按需選擇。具體到上文文獻中希望減少正電荷的場景，我們可以選擇維持或降低pI的組合。?

當然，除了推薦的輕重鏈模板組合，也可以基于前面講的基于germline序列的pI分析，自由指定輕重鏈分別使用特定pI的germline對抗體FR進行替換，非常靈活。

除了這些功能，WeMol中還可以自動化完成抗體人源化設計的全流程，涉及抗體建模、人源模板比對與挑選、回復突變評價和分組、序列生成、PTM分析、免疫原性預測、專利實施例段落生成等步驟，具有高成功率、易使用、速度快、功能全面等特點，經過了上百個人源化項目的濕實驗驗證，能有效降低時間和成本。

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