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自從首個單克隆抗體muromonab（OKT3）被批用于臨床治療以來，治療性抗體的開發經歷了鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、全人源抗體的幾個發展階段。近年來，隨著全人源噬菌體展示文庫技術以及人源化轉基因小鼠技術的發展，全人源抗體在臨床上得到越來越多的運用。然而，由于技術可及性及成熟性，成本控制，成藥性等方面的原因，目前人源化抗體仍然占據了市場上單克隆抗體的40%以上（圖1）。通過免疫小鼠獲得高親和力和生理活性的雜交瘤單抗，再通過抗體可變區基因克隆獲得其蛋白序列，進而通過抗體的人源化改造獲得人源化抗體，仍然是目前治療性抗體發現的常規策略。由于抗體人源化的改造涉及抗體氨基酸序列甚至結構的變化，使用計算機輔助藥物設計技術進行基于結構的抗體人源化設計，可以在人源化過程中既保持或基本保持其鼠抗或嵌合抗體形式對抗原的親和力，特異性，生理學活性，又同時不影響其藥物可開發性（developability, 通常表現為表達水平，理化性質，穩定性等）。
圖1. 不同程度人源化抗體在上市藥物中的占比(數據截至2018年9月)
抗體可變區的序列編號系統，CDR定義以及基本結構特征
由于抗體人源化的過程伴隨著抗體序列和結構特別是重輕鏈可變區的分析和改造，在介紹人源化改造策略之前，我們有必要來認識一下抗體可變區序列和結構的基本特征，這些特征同時也是抗體文庫構建，體外親和力成熟等其他抗體工程學改造的基礎。
抗體可變區基因由免疫球蛋白基因V, D, J片段經過VDJ重排而來(對于輕鏈是VJ重排)，其中V基因編碼了抗體可變區N端起始到CDR3前的大部分區域（輕鏈V基因還編碼部分CDR3），CDR3通常由D基因和J基因共同編碼（對于輕鏈CDR3是V基因和J基因共同編碼），J基因則編碼了CDR3的C端以及FR4的部分。對于人免疫球蛋白VDJ胚系基因的具體編碼序列，可進一步查閱Vbase數據庫（http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/）。
抗體可變區（VH或VL，包括前述VDJ基因組成的部分）通常分為框架區（framework）和互補決定區（complementarity-determining region，CDR），其中CDR區又被稱為超可變區（hypervariable region）。目前通常認為CDR區參與了抗原-抗體的結合作用，但在歷史上，CDR區的鑒定是通過比對一系列抗體序列，通過比較其可變程度來確定的。同時，由于抗體可變區特別是CDR區不但存在序列的差異，也存在長度的差異，如果按常規方法對抗體按數字順序編號，會出現保守的同一個位點在不同抗體中編號位數不一致的情況。為了克服這一問題，Kabat等最早通過比較大量的抗體可變區序列，發明了經典的Kabat氨基酸序列編號系統和CDR定義系統，這種系統通過在長度可變區域的氨基酸位數引入a, b, c等字母標識的方法，保證了保守的氨基酸位點在不同的抗體中具有一致性。其他常用的類似的CDR定義和編號系統包括IMGT系統，Chothia系統等。以Pembrolizumab（Keytruda）抗體重鏈可變區為例，CDR區以及氨基酸編號標識如下（圖2）：
圖2. 抗體CDR區標注以及氨基酸序列編號
從結構上看，抗體可變區由9個β strand組成兩個β sheet，同時每個strand之間由loop結構連接，而三個CDR的位置總體上與loop BC，loop C’C”以及loop FG對應?（圖3）。值得注意的是，如上所述，由于CDR最早是基于序列可變性的定義，這種結構生物學上的loop結構與CDR區并非完全對應，且不同CDR定義系統中CDR與loop結構的一致性程度不同。
圖3. 抗體可變區β strand的結構示意圖（AntibodyEngineering, Volume 2, Springer Protocols, 2010）
進一步研究抗原抗體復合物結構發現大概只有三分之一的CDR區域的氨基酸殘基直接參與了與抗原的結合，而這部分氨基酸序列的變化程度相較CDR其他部分更高，人們把這部分氨基酸殘基叫做特異性決定殘基（Specificity-Determine Residue），把包含這些SDR的區域命名為小型CDR（abbreviated-CDRs，aCDRs)。對于Chothia CDR系統，其hypervariable loop（HV），CDR以及aCDR的相對關系如下圖所示（圖4）：
圖4 HV loop, CDR以及aCDR相對位置示意圖（Chothia編號系統）
Chothia等人進一步的研究發現，除了CDRH3以外的五個CDR其在序列和結構上呈現一些固定的特點，表現為相對于某一特定的CDR長度，其在CDR或Framework區有一些保守的位點，這些位點通常為幾種固定類型的氨基酸殘基，這些殘基對于維持CDR/loop區的構象是比較重要的，這些固定類型的結構被稱為抗體的Canonical Structure。另外，Foote 和 Winter等人的研究也發現，在CDR毗鄰區域存在一些起到支撐起CDR/loop區域的一些關鍵氨基酸，其中重鏈可變區16個，輕鏈可變區14個，這些區域被命名為Vernier Zone。Vernier Zone與Chothia等人鑒定的Canonical Structure殘基在一定程度上有重疊。在重鏈可變區和輕鏈可變區，CDR，aCDR，hypervariable loop，Canonical Structure Residues, Vernier Zone等區域的位置如下圖（圖5,6）所示：
圖5 輕鏈可變區CDR及其他結構相關位點示意圖
圖6 重鏈可變區CDR及其他結構相關位點示意圖
CDR移植：最為常見和成熟的人源化改造策略
如上文所述，既然CDR區域主要參與抗體與抗原的相互作用，那最常規的人源化思路就是把這些決定抗原-抗體相互作用的CDR區域移植人的Framework區域中去，從而降低鼠抗在人體中產生的免疫原性。CDR移植的方法最早由2018年諾貝爾化學獎得主Greg Winter團隊在20世紀80年代后期提出，經過幾十年的發展，該技術目前已經相對成熟，也是目前業界使用最為廣泛，最為認可的人源化策略。
基于CDR移植的人源化策略主要分為以下幾個步驟：1) 選定移植區域；2) 選定合適的Framework供體（有時候也叫做Framework受體）；3) 對影響抗體結構和功能的關鍵氨基酸進行回復突變。下文將從這三個方面對該策略進行展開論述。
選定移植區域
抗體人源化項目開展之前最理想的方式是得到抗體-抗原復合物的晶體結構，這有助于理性地分析哪些區域參與了抗原-抗體的相互作用，從而選定這些區域作為CDR移植的供體。但遺憾的是，大絕大多數情況下，這種結構信息通常是不存在的。對于這種情況，通常采用全部六個CDR區作為移植的供體。如前所述，由于CDR是最早是基于序列的定義，其在結構上與參與抗原-抗體相互作用的loop區有重疊但并非完全一致，而不同方法定義的CDR區域也有所不同，此時可以結合結構信息，綜合選定所要移植的區域。對于一個已知序列未知結構的抗體，目前有很多商業化軟件(如MOE, Schrodinger/Bioluminate等)可以提供抗體結構的同源建模分析。
如上所述，如果項目對人源化程度/免疫原性比較在意，希望盡量少地移植鼠抗序列，那可以考慮只進行SDR而非CDR的移植?；蛘咄ㄟ^突變體結合實驗，證明某些CDR可能并不參與抗原抗體的相互作用，從而只移植部分CDR區域，這些方法都成功的案例報道。
選定Framework供體
在CDR移植技術的發展過程中，人們對于供體Framework的選定有不同的方法。人們最早采用直接把鼠源CDR移植到一些已知結構的人源抗體中，其中并不考慮鼠源抗體與人源抗體在序列上的同源性。但是這種方法得到的移植后抗體往往親和力較鼠抗或嵌合抗體有明顯的下降。這使人們認識到不同人源抗體Framework對被移植的CDR結構的支持作用是不一樣的。進而人們考慮選擇與鼠抗同源性較高的人抗體Framework序列作為移植供體，這種方法被稱為Best Fit策略。如前所述，除了比較序列一級結構的同源性，可以在選定供體Framework的時候就考慮其與被移植抗體在Canonical結構上的一致性，這往往有助于CDR loop結構的維持與抗原-抗體親和力的保持。也有人在供體Framework序列中不考慮Framework的同源性，而是考慮CDR區域的同源性，這也是基于選定的Framework序列能夠較好地支持CDR結構的考慮。
關于Framework序列的來源有兩種，一種是發表的人源或人源化抗體序列，這些序列可以通過PDB, IMGT等數據庫獲得，但是這些人源序列往往已經經歷體細胞高頻突變過程，其Framework區已經積累一些突變，這些突變對于候選抗體可能是無益且存在免疫原性風險的。第二種來源是未成熟的人胚系基因（germline gene），這些基因未經體細胞高頻突變，理論上產生免疫原性的可能性更低。另外，也有研究表明，相對于體細胞成熟的抗體，germline序列作為Framework能夠給CDR區域提供更好的柔性，使得被移植的CDR結構能夠更好地保持。目前人們更多地使用germline gene framework而非成熟抗體framework作為移植的Framework供體。
確定回復突變位點
CDR移植后的抗體通常其親和力會發生降低，這可能是由于前述的一些支撐CDR結構的關鍵位點在人源化的過程中發生了改變。為了恢復抗體的結合和生理活性，往往需要對CDR移植后的抗體進行關鍵氨基酸的回復突變，保留其鼠源序列。在此過程中，往往需要考慮親和力/功能/可開發性等與免疫原性/人源化程度的平衡。對于不同的項目，其所需要的回復突變數量不盡相同，而其中的突變位點的選擇也十分關鍵。如前所述，抗體中存在的Canonical Structure與Vernier Zone等區域的氨基酸可能對于維持CDR loop結構非常重要，如果在人源化過程中，這些殘基發生了突變，可能對其結構和活性的維持具有重要影響，因此這些關鍵的氨基酸位點通常是給予首先考慮進行回復突變的。另外，Framework內部與CDR區域在空間上比較近的區域，比如通常認為5A或3A以內的Framework氨基酸，可能對與CDR區域存在分子內相互作用，或者直接參與了與抗原的相互作用，這些氨基酸如果在人源化過程中被突變，也可以納入回復突變的候選位點。通過抗體已知或建模結構的分析，綜合不同級別優先性的重輕鏈回復突變，再對這些不同回復突變的突變體進行重輕鏈的棋盤式組合，可以篩選到回復突變較少，而親和力/生理功能/可開發性符合項目預期的藥物候選分子。
利用表面重塑技術（Resurfacing）進行抗體的人源化
表面重塑技術（Resurfacing）是除了CDR移植外一個比較常見的策略，其設計思路與CDR移植類似，但是在選定突變位點的時候只考慮將處于抗體結構表面的氨基酸人源化，而將位于抗體結構內部的氨基酸維持其鼠源抗體序列。這在很大程度上減少了人源化過程中所需要突變的氨基酸數量，從而有助于抗體保持其抗原親和力及生理功能。這種設計的原理是考慮ADA產生的過程中，需要B細胞通過BCR來識別抗體表面的B cell epitope，而其內部的鼠源序列因為沒有暴露而不會被B細胞識別從而產生ADA反應。盡管如此，Resurfacing技術由于案例有限，其臨床安全性和免疫原性有待于進一步評估。
利用Framework library進行抗體的人源化候選分子的篩選
這種技術是將CDR移植技術與噬菌體文庫技術相結合，在某些與維持CDR結構緊密相關的氨基酸位點，如前述Vernier Zone等區域進行隨機化文庫構建，利用噬菌體淘選（panning）技術，淘選出了與靶抗原具有高親和力的人源化突變體作為藥物候選分子。
利用Chain Reshuffling技術進行抗體的人源化
這種人源化技術也叫guided selection，其已經成功運用于TNFa抗體Humira的人源化過程中。這個方法也是Greg Winter教授團隊最早開發，其思路是先將鼠抗的重鏈可變區VH固定，構建人輕鏈shuffling文庫，通過噬菌體文庫技術篩選出與TNFa能夠維持高親和力的候選分子，進而選定此候選分子的VL序列，構建人重鏈shuffling文庫，篩選得到重輕鏈全被替換成人源抗體的藥物候選分子。
利用HSC（Human String Content）打分系統進行抗體人源化
此方法由Lazar等人最先提出，其核心的觀點認為鼠抗內存在的能夠與人抗原提呈細胞表面MHC II分子相結合并被T細胞TCR所識別的線性T細胞表位對于ADA的產生起到決定性作用，而常規的CDR移植過程中，盡管Framework區大部分被替換為人germline序列，但是其CDR區域以及CDR-Framework交界區域存在的潛在T細胞表位被忽視從而產生抗體藥物的免疫原性。而HSC打分算法就將抗體的這種T細胞表位進行整體評分，評分越高代表其T細胞表位越少，人源性更高，而人源化的設計過程是通過突變來提高其HSC打分從而降低其免疫原性。
總結
抗體的免疫原性一直是業界比較關注的熱點問題，盡管免疫原性的產生與抗體人源化程度不一定具有完全相關性，如抗體后續開發工藝和質量標準（如aggregation），不同適應癥病人免疫亢奮狀態等都會影響臨床上ADA的產生，但是在早期開發階段盡可能地提高抗體的人源化程度是目前業界的共識。而如何進行人源化策略的選擇對于保持抗體的功能和成藥性都具有十分重要的影響。目前來看，CDR移植仍然是最為通用和被廣泛接受的人源化策略。利用基于結構的藥物設計技術可以快速精確地進行設計，從而加速抗體藥物的研發進程。
參考文獻
- Almagro J C, Fransson J. Humanization of antibodies[J]. Front Biosci, 2008, 13(1): 1619-1633.
- Safdari Y, Farajnia S, Asgharzadeh M, et al. Antibody humanization methods–a review and update[J]. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 2013, 29(2): 175-186.
- Ahmadzadeh V, Farajnia S, Feizi M A H, et al. Antibody humanization methods for development of therapeutic applications[J]. Monoclonal antibodies in immunodiagnosis and immunotherapy, 2014, 33(2): 67-73.
- Lazar G A, Desjarlais J R, Jacinto J, et al. A molecular immunology approach to antibody humanization and functional optimization[J]. Molecular immunology, 2007, 44(8): 1986-1998.
- Antibody Engineering, Volume 1&2 (secondedition), edited by Roland Kontermannand Stefan Dübel, Springer Protocols(2010).